要一次進(jìn)行這么多種反應(yīng)，我們當(dāng)然不想在反應(yīng)中缺了哪個(gè)組分。一般多重PCR需要更多的dNTP、鎂離子和聚合酶。Nichols推薦使用0.3 mM dNTP（而非標(biāo)準(zhǔn)的0.2 mM）、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反應(yīng)體系5 units聚合酶（而非1.25 units）。zui后再試試鹽濃度，“在優(yōu)化的時(shí)候，增加鹽總會(huì)有幫助，尤其能增加特異性。"ELISA試劑盒
PCR master mix含有緩沖液、鹽、dNTP、Mg和聚合酶，如果我們使用常規(guī)1.25× 或1.5×的PCR master mix就已經(jīng)差不多做到了上述原則的三至五。另外，您還可以選用轉(zhuǎn)為多重PCR優(yōu)化的產(chǎn)品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ? Multiplex Powermix、或者安捷倫的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。
據(jù)安捷倫的Mason介紹，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經(jīng)過(guò)專門設(shè)計(jì)的，能夠很好的解決同一管中不同反應(yīng)相互競(jìng)爭(zhēng)的問(wèn)題。如果一個(gè)目標(biāo)片段出現(xiàn)1000次，而另一個(gè)目標(biāo)片段只出現(xiàn)了10次，那么后一個(gè)片段就很容易淪為背景。“我們的多重PCR試劑盒能夠在同一個(gè)管中準(zhǔn)確定量低豐度和高風(fēng)度的目標(biāo)片段，克服偏向性，"Mason說(shuō)。
我能擴(kuò)多少目標(biāo)片段一般來(lái)說(shuō)，zui多能在同一個(gè)管中同時(shí)檢測(cè)到五個(gè)目標(biāo)片段，這既是出于引物設(shè)計(jì)的考慮，也是由多重定量PCR的硬件條件決定的。實(shí)時(shí)熒光PCR儀通常zui多檢測(cè)4至5個(gè)顏色通道，其中一個(gè)可能還要留作參考通道。凝膠電泳雖然不受此限制，但多引物一同作用仍然存在困難，因此還是zui多達(dá)到五重PCR。 “設(shè)計(jì)更多是挑戰(zhàn)性的，"Cockrum說(shuō)。
多重定量PCR的染料能進(jìn)行多重定量PCR的儀器包括：Life Tech公司的QuantStudio? 12K Flex Real-Time PCR System、安捷倫公司的Mx30005P等等。目前zui流行的選擇是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的zui普遍的。Life Tech除了VIC外，近期又發(fā)布了兩個(gè)新染料ABY和JUN以及一個(gè)新passive reference dye——Mustang Purple。ELISA試劑盒
Cockrum建議將染料強(qiáng)度與模板豐度結(jié)合起來(lái)，用zui亮的染料（通常是FAM）配zui少的模板，用zui黯淡 的染料（例如Cy5或Quasar 705）配豐度zui高的模板（如看家基因）。
更多重的PCR當(dāng)然，引物設(shè)計(jì)是多重PCR的zui大障礙，不過(guò)一旦克服了這一障礙我們就能進(jìn)行更多重的PCR反應(yīng)。安捷倫的MassCode技術(shù)就能夠超越定量PCR儀帶來(lái)的硬件限制，安捷倫公司將這一技術(shù)推薦給那些想要同時(shí)篩選十個(gè)以上目標(biāo)片段的用戶，例如可以用來(lái)檢測(cè)病原體。ELISA試劑盒
會(huì)員_a.png)