許多化合物可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生基因突變、較大范圍染色體損傷、重組和染色體數(shù)目異常等不同形式的DNA損傷，從而造成機(jī)體潛在的遺傳危害。致癌實(shí)驗(yàn)可檢出機(jī)體DNA損傷及其損傷的形式并甄別這些化合物的致癌性，在實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性的化合物為潛在人類(lèi)致癌劑和(或)致突變劑。致癌實(shí)驗(yàn)可分為活體內(nèi)致癌實(shí)驗(yàn)(整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn))與試管內(nèi)致癌實(shí)驗(yàn)。比較于活體內(nèi)致癌實(shí)驗(yàn)．試管內(nèi)致癌實(shí)驗(yàn)具有簡(jiǎn)單易行、快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)。試管內(nèi)致癌實(shí)驗(yàn)是采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法來(lái)觀察致癌劑的致癌作用。實(shí)驗(yàn)中真核細(xì)胞更能直接地檢出致癌劑對(duì)人類(lèi)或其他高等生物的遺傳危害；根據(jù)致癌劑類(lèi)別選擇合適的細(xì)胞，觀察細(xì)胞DNA損傷的形式及程度來(lái)判定致癌劑的致癌特性。
一、原理
DNA分子量很高且具有嚴(yán)密的超螺旋結(jié)構(gòu)。因此，在理想條件下，正常細(xì)胞DNA在電泳之后仍應(yīng)保持在原來(lái)位置。而DNA受損后，DNA片斷從嚴(yán)密的超螺旋結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)；由于這些DNA斷鏈分子量較小且堿變性為單鏈，所以在電泳電場(chǎng)中就可以離開(kāi)核DNA在凝膠分子篩中向陽(yáng)極移動(dòng)，形成慧星狀圖像，故稱(chēng)彗星試驗(yàn)。DNA受損傷愈嚴(yán)重，產(chǎn)生的斷鏈和變性片斷就愈多，斷鏈也愈??；在相同電泳條件下遷移的DNA量就愈多，遷移的距離就愈長(zhǎng)。因此，通過(guò)測(cè)定DNA遷移部分的光密度或遷移長(zhǎng)度就可定量測(cè)定DNA損傷程度，確定致癌劑與DNA損傷效應(yīng)之間的關(guān)系。
二、材料與方法
(一)實(shí)驗(yàn)材料
1．待檢人抗凝外周血。
2．磷酸鹽緩沖液PBS。
3．0．4mmol／LTris—HCl(pH7．5)。
4．0．5％正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)。
5．0．5％低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)。
6．細(xì)胞裂解液 含2．5mol／L NaCl、100mmol／L Na2 EDTA、10mmol／L Tris—Hcl(pHl0)、1％肌氨酸鈉，用前加lO％二甲基亞砜。
7．電泳緩沖液1 mmol／L Na2EDTA、300mmol／L NaOH。
8．30 μg／ml溴化乙啶(EB)。
9．淋巴細(xì)胞分離液比重I．077~1．080g／ml。
(二)實(shí)驗(yàn)方法
1．人外周血淋巴細(xì)胞分離從健康人靜脈采抗凝血0．5~lml，沿離心管管壁滴加在等體積淋巴細(xì)胞分離液液面上，3500 r／min離心2min，吸取中間層淋巴細(xì)胞于10ml離心管中，加磷酸鹽緩沖液(PBS)至5ml，1500r／min離心8min，如此重復(fù)洗滌細(xì)胞兩次，再將細(xì)胞懸于PBS，置4℃待用。
2．紫外線照射或化學(xué)處理取新鮮分離的淋巴細(xì)胞或其他細(xì)胞懸液，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)細(xì)胞／ml，用待測(cè)化學(xué)物37℃處理2～4h或于冰水浴中經(jīng)紫外線照射，隨后將細(xì)胞保存在4℃或冰水浴中。
3．三層凝膠法制板將i00pI NMA 40℃預(yù)熱后滴在載玻片上，迅速蓋上干凈的蓋玻片，4℃凝固。將10p1含有1000個(gè)受檢人血淋巴細(xì)胞的PBS和75μl LMA 37℃預(yù)熱并混合，滴到*層瓊脂糖上，4℃凝固。滴加75μl 37℃預(yù)熱的LMA于第二層瓊脂糖上，蓋上蓋玻片4℃凝固。
4．細(xì)胞裂解將凝膠水平浸入新配制的預(yù)冷的4℃細(xì)胞裂解液，破壞細(xì)胞膜、核膜和其他生物膜。
5．DNA堿解旋將凝膠取出，用吸水紙吸干裂解液，并置于水平電泳槽的陽(yáng)，電泳槽中盛有新配制的堿性電泳緩沖液，放置40min，使DNA在堿性條件下解螺旋。
6．單細(xì)胞電泳在電壓25V、電流300mA下，電泳40min。
7．中和與染色 電泳后將載玻片凝膠平放在小瓷盤(pán)內(nèi)，緩緩沿壁加入Tris—HCl(DH7．5)緩沖液，將凝膠淹沒(méi)15 min，再將Tris—HCl緩沖液吸去，用濾紙將盤(pán)內(nèi)液體吸干，再緩緩加入無(wú)水乙醇將凝膠浸埋lh。之后，吸去乙醇，晾干或室溫下過(guò)夜。每塊凝膠加50μl EB水溶液，再蓋上蓋玻片染色20min。
三、結(jié)果觀察
染色后的樣本應(yīng)盡快在熒光顯微鏡下觀察電泳圖像，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇25個(gè)細(xì)胞，盡快用目鏡測(cè)微尺測(cè)定核DNA直徑和DNA遷移的長(zhǎng)度。有條件者可借助圖像分析儀進(jìn)行分析。
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