1、什么是定量PCR？

　　以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。

　　2、定量PCR定量的理論依據(jù)是什么？

　　特定的待擴(kuò)增基因片段起始含量越大，則指數(shù)擴(kuò)增過(guò)程越短，當(dāng)擴(kuò)增速率趨于穩(wěn)定后，則無(wú)論原來(lái)樣品中起始模板含量多少，終擴(kuò)增片段的含量通常是一樣的。

　　理想的擴(kuò)增結(jié)果：Y=X×2n其中Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量，X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù)n為擴(kuò)增次數(shù)；理論上PCR擴(kuò)增效率為*，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長(zhǎng)，但實(shí)際上：DNA的每一次復(fù)制都不*，即每一次擴(kuò)增中，模板不是呈2的倍增長(zhǎng)；實(shí)際應(yīng)為：Y=X(1+E)n，其中E代表擴(kuò)增效率：E=參與復(fù)制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中不是固定不變的。通常X在1～105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時(shí)，E相對(duì)穩(wěn)定，原始模板以相對(duì)固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；隨著循環(huán)次數(shù)n的增加（>30次），E值逐漸減少，Y呈非固定的指數(shù)形式增加，后進(jìn)入平臺(tái)期。

　　3、熒光定量PCR定量的理論模式又是什么？

　　PCR是對(duì)原始待測(cè)模板核酸的一個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，任何干擾PCR指數(shù)擴(kuò)增的因素都會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量，使得PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒(méi)有一個(gè)固定的比例關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增終產(chǎn)物很難對(duì)原始模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。近年來(lái)研究人員通過(guò)大量的實(shí)踐，研究了相對(duì)準(zhǔn)確的定量PCR方法，即熒光定量PCR。

　　PCR擴(kuò)增通式：①Tn=T0（1+E）n

　?、赥n=Tn-1（1+E）n注：[0

　　其中E表示擴(kuò)增效率，n為循環(huán)數(shù)，Tn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，Tn-1表示在n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，T0為原始模板數(shù)量。設(shè)定PCR到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，產(chǎn)生一定的熒光(熒光依賴于某一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的總量，即特定的拷貝數(shù)K，為常數(shù)，大約在1010左右)高于背景為儀器所識(shí)別，此時(shí)的循環(huán)數(shù)為CP（crossingpoint）,也就是K=T0（1+E）CP，取對(duì)數(shù)即：

　　lgK=lgT0+CP*lg(1+E)

　　CP=-1/lg(1+E)*lgT0+lgk/lg(1+E)

　　pcr核酸檢測(cè)試劑盒的成分產(chǎn)品組成：DNA提取液2、CTPCR反應(yīng)液、HS-Taqplus酶、UNG、CT陰性對(duì)照、CT臨界陽(yáng)性對(duì)照、CT強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照。產(chǎn)品有效期：貯存于-20℃，有效期12個(gè)月。附件：注冊(cè)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

　　適應(yīng)癥該產(chǎn)品用于對(duì)人尿道、生zhi道分泌物拭子樣本中的沙眼衣原體核酸DNA的檢測(cè)

　　PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開(kāi)始時(shí),探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

　　pcr核酸檢測(cè)試劑盒的檢驗(yàn)原理：pcr核酸檢測(cè)試劑盒從人血清或血漿中提取丙型肝炎病毒核酸（HCVRNA），通過(guò)RT-PCR一步法反應(yīng)，利用特異性引物對(duì)HCVRNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，在體系中采用Taqman-MGB探針?lè)ú⒔Y(jié)合非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)技術(shù)來(lái)定量檢測(cè)人血清或血漿中丙型肝炎病毒核酸（HCVRNA）的數(shù)量。可用于臨床對(duì)丙型肝炎的輔助診斷和抗病毒yao物的療效觀察。